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直接的な答え: ほとんどのウェスタンブロットでは、PVDF がより安全なデフォルトです。PVDF はより高いタンパク質結合容量 (170 ～ 200 μg/cm2 対 80 ～ 100 μg/cm2)、より優れた機械的耐久性を備え、ストリッピングと再プローブをサポートします。しかし、ニトロセルロースも劣っているわけではありません。バックグラウンドが低く、メタノール活性化ステップがなく、小さなタンパク質 (< 25 ～ 30 kDa) に適しています。正しい選択は、標的タンパク質のサイズと存在量、検出方法、および再プローブが必要かどうかによって異なります。どちらの膜も普遍的に「優れている」というわけではありません。
ニトロセルロースとPVDFはどちらも 曲がりくねった経路膜 — タンパク質は、相互接続された細孔の三次元ネットワークを通って移動し、外面だけでなく内面領域にも結合します。この構造により、両方のメンブレンに、その平坦な寸法が示すよりもはるかに高い有効結合表面が与えられます。
バインドメカニズムは次のように異なります。
この濡れ挙動の違いは、ラボにおける PVDF 転写失敗の最も一般的な原因です。実験中に乾燥した PVDF 膜は、続行する前に再度湿らせる必要があります。
| パラメータ | ニトロセルロース | PVDF |
|---|---|---|
| タンパク質結合能 | 80 ～ 100 μg/cm2 | 170 ～ 200 μg/cm2 |
| 結合機構 | 疎水性静電性 | 疎水性双極子 – 双極子 |
| メタノールによる事前湿潤が必要 | いいえ | はい |
| 機械的耐久性 | 壊れやすい、破れやすい | 丈夫で耐薬品性がある |
| 背景雑音 | 低い | 中程度 (蛍光があるとより強くなります) |
| 感度 (低濃度タンパク質) | 中等度 | 高 |
| 最適な分子量範囲 | 低い MW (< 25–30 kDa) | 高 MW (> 100 kDa) |
| ストリッピングと再プローブ | 難しい — 信号損失 | 素晴らしい |
| 蛍光検出 | いいえt recommended (high autofluorescence) | はい — use low-fluorescence PVDF |
| 質量分析 (MS) ダウンストリーム | いいえ | はい |
| タンパク質配列決定 (エドマン分解) | いいえ | はい |
| 核酸ブロッティング（DNA/RNA） | はい | いいえ |
| 相対コスト | 低いer | 高er |
膜の選択に関して最もよく誤解されているのは、分子量と膜の選択の関係です。
「高感度の検出には PVDF を使用し、日常的な作業にはニトロセルロースを使用する」という従来のアドバイスには、重要なニュアンスが欠けています。 2021 年の体系的な研究が、 科学レポート 低分子量、中分子量、および高分子量のタンパク質にわたる両方の膜の結合能力を比較しました。調査結果は次のとおりです。
その理由は、転送バッファーの構成に関係しています。ニトロセルロース転送プロトコルでは通常、転送バッファーにメタノールが含まれます。メタノールはエレクトロトランスファー中のゲルの細孔サイズを小さくし、小さなタンパク質がゲルを通って逆流するのを防ぎ、メンブレン上での小さなタンパク質の保持力を向上させます。ただし、この同じメタノールは、ゲルからの大きなタンパク質の移動性を低下させ、高分子量ターゲットの転写効率を損ないます。
PVDF では、転送バッファーにメタノールを必要としません。メタノールがなければ、大きなタンパク質はより効率的に移動します。これが、PVDF が 100 kDa を超えるタンパク質に対して常にニトロセルロースよりも優れたパフォーマンスを発揮する理由です。
実践的な MW 選択ガイド:
| 標的タンパク質の分子量 | 推奨メンブレン | 理由 |
|---|---|---|
| < 15 kDa (小さなペプチド) | ニトロセルロース (0.2 µm) | 低分子タンパク質の保持力が向上。緩衝液中のメタノールが効果的 |
| 15～30 kDa | ニトロセルロース or PVDF | どちらでも受け入れられます。 ノースカロライナ州 がやや好ましい |
| 30～100 kDa | PVDF | 高er binding capacity, reliable detection |
| > 100 kDa | PVDF (メタノールフリーの転写バッファー) | ノースカロライナ州 メタノールは大量のタンパク質の移動を阻害します |
| 広いMW範囲にわたる複数のターゲット | PVDF | 全範囲にわたってより安定した |
どちらのメンブレンも 3 つの標準細孔サイズでご利用いただけます。孔径は膜の材質とは別個に決定されます。両方を独立して選択します。
| 孔径 | 最適な用途 | いいえtes |
|---|---|---|
| 0.1μm | タンパク質 < 10 kDa、非常に小さなペプチド | 高est retention, highest background risk |
| 0.2μm | タンパク質 < 20 kDa;負荷の低い定量的な作業 | 小さなたんぱく質をバランスよく配合 |
| 0.45μm | タンパク質 > 20 kDa;標準アプリケーション | ほとんどのウェスタンブロットのデフォルト |
ルール: 標的タンパク質が小さい (< 15 kDa) か、ローディング量が少なく定量が重要な場合は、膜の材質に関係なく、常に 0.45 µm ではなく 0.2 µm を使用してください。細孔サイズが小さいため、転写中のタンパク質の流出が減少します。
メンブレンの選択は、検出戦略に合わせて行う必要があります。
どちらのメンブレンも完全に互換性があります。これは最も一般的な検出方法であり、区別が最も少ない方法です。どちらの膜でも機能します。他のすべての要素が同じで、ECL を使用している場合は、タンパク質の MW と再プローブのニーズに基づいて選択します。
低蛍光PVDFを使用。 標準的なニトロセルロースは、蛍光検出チャンネルに染み込む高い自己蛍光を持っています。これにより、バックグラウンドが上昇し、弱い信号がわかりにくくなり、2 色の多重化の信頼性が低くなります。標準の PVDF にも中程度の自家蛍光があります。蛍光ベースのウェスタンブロット (LI-COR Odyssey システムなど) の場合は、次のように指定します。 低蛍光PVDF 明示的に、これは単なる標準の PVDF ではなく、別個の製品カテゴリです。
両方のメンブレンに互換性があります。ニトロセルロースは、ブロッキング特性が優れているため、比色基質のバックグラウンドが低くなる傾向があります。
どちらも互換性があります。ニトロセルロースは、放射性物質検出の歴史的な標準であり、この用途には若干好まれます。
実験で同じメンブレンを複数の一次抗体でプローブする必要がある場合、異なるターゲットに対して連続的に、またはストリッピング後にローディング コントロールで再プローブするかどうかにかかわらず、メンブレンの耐久性が重要になります。
標準ニトロセルロース 壊れやすいです。高温の SDS バッファーまたは還元剤 (β-メルカプトエタノール) を使用するストリッピング プロトコルは、メンブレンに機械的な損傷を与え、タンパク質の損失を引き起こします。 2 番目のプローブ後の信号は、通常、最初のプローブの 30 ～ 60% です。 3 サイクル後、メンブレンは使用できなくなることがよくあります。
サポートされているニトロセルロース (ポリエステルまたはナイロンの裏地) は耐久性が大幅に高く、サポートされていない NC よりも剥離や再プローブに耐えることができますが、それでも PVDF には劣ります。
PVDF 耐薬品性があり、機械的に堅牢です。信号損失を最小限に抑えながら、複数回の剥離サイクルに耐えます。 PVDF メンブレンは、要求の厳しい研究ワークフローにおいて 5 ～ 7 回の再プローブに成功しています。
| 再プローブ要件 | 推奨メンブレン |
|---|---|
| 単一プローブ、再プローブなし | どちらか — MW と検出方法によって選択します |
| ローディング制御のみ（2プローブ） | サポートされている NC または PVDF |
| 3 つのプローブまたは複数のストリッピング サイクル | PVDFのみ |
| メンブレンを保管し、数か月後に再プローブします | PVDF (乾燥した状態で保管); NCは時間の経過とともに劣化します |
転写前に PVDF をメタノールで事前に湿らせることはオプションではなく、必須です。 PVDF は疎水性です。メタノールで活性化する前にメンブレンが水性転写バッファーに接触すると、表面張力によりバッファーの浸透が妨げられ、タンパク質は結合しません。その結果、バンドのないブランクのメンブレンが得られます。これは、経験の浅い研究室で PVDF ウェスタンブロットが失敗する一般的な原因です。
PVDF アクティベーション プロトコル:
転送バッファ自体の場合:
PVDF は結合能力と耐久性において全体的に優れているにもかかわらず、特定のシナリオではニトロセルロースが優れています。
低分子タンパク質 (< 25 ～ 30 kDa): NC メタノール転写バッファーは、メタノールを使用しない PVDF よりも小さなタンパク質をよりよく保持します。ヒストン (11 ～ 17 kDa)、β-アクチン (42 kDa、境界付近)、サイトカイン (8 ～ 25 kDa) などの標的に対して、NC は同等以上のパフォーマンスを発揮します。
豊富なタンパク質を含む日常的な使い捨て用途: ターゲットが高度に発現されている場合、感度よりもバックグラウンド ノイズが重要であり、NC によりバックグラウンドが低くなります。再プローブを行わずに高発現タンパク質の日常的な品質管理ブロットを行う場合、NC の方が安価で簡単です。
メタノール耐性なし: 一部の研究室では、安全性や廃棄物処理、または移送システムが高メタノール緩衝液と互換性がないため、メタノールを避けています。 NC はこの懸念を完全に解消します。
核酸検出 (サザン/ノーザンブロット): NC は DNA および RNA ハイブリダイゼーションと互換性があります。 PVDF は核酸ブロッティングには適していません。
ドットブロッティングとスロットブロッティング: NC はこれらのアプリケーションの歴史的な標準であり、今でも広く使用されています。
質量分析の下流分析: タンパク質のバンドを切り出し、LC-MS/MS 同定またはシーケンスに送る場合、互換性のあるメンブレンは PVDF だけです。ニトロセルロースは、エドマン分解 (タンパク質配列決定) およびほとんどの MS サンプル前処理プロトコルと互換性がありません。
蛍光ベースのウェスタンブロット: 低蛍光 PVDF は、NIR 蛍光多重化と互換性のある唯一のメンブレンフォーマットです。 NC 自家蛍光により使用できなくなります。
高分子量タンパク質 (> 100 kDa): 大きなターゲット (例: 289 kDa の mTOR、3,000 kDa のタイチン) の一貫した高品質のバンドには、低メタノールまたはメタノールを含まない転写バッファーを使用した PVDF が必要です。
複数の再プローブサイクル: 2 回以上のストリッピングと再検出を必要とする実験デザインでは、PVDF を使用する必要があります。
メンブレンの長期保管: PVDF メンブレンは室温で乾燥した状態で保存でき、数か月または数年後に信号を損失することなく再水和できます。 NC は時間の経過と保管により劣化します。
| 問題 | おそらく膜 | 原因 | 修正 |
|---|---|---|---|
| いいえ bands on PVDF | PVDF | 実験中に膜が乾燥した。アクティベーションがスキップされました | メタノールで再度湿らせます。実験中は絶対に PVDF を乾燥させないでください |
| 高 background with fluorescence | NC または標準 PVDF | 自家蛍光 | 低蛍光PVDFへの切り替え |
| NC 上の大きなタンパク質 (> 100 kDa) のシグナルが弱い | NC | メタノールは大量のタンパク質の移動を妨げます | PVDF に切り替え、低メタノール転送バッファーを使用 |
| NC剥離後の信号損失 | NC | サポートされていない NC の機械的脆弱性 | PVDF またはサポートされている NC に切り替える |
| PVDF をメタノールでプレウェットした後の弱いバンド | PVDF | バッファーはメタノール後に平衡化されません。膜が部分的に乾燥している | 転送バッファーで 5 分間完全に平衡化することを確認します。 |
| 膜から欠落した小さなタンパク質 | どちらか | 間違った細孔サイズ (0.45 µm) | 20 kDa 未満のタンパク質には 0.2 µm の細孔サイズを使用します |
| 膜を横切る不均一な転写 | どちらか | ゲルとの不均一な接触。気泡 | 気泡を広げます。転写カセット内の圧力を均一に保つ |
次の場合はニトロセルロースを使用してください。
次の場合に PVDF を使用します。
本当に問題ではない場合: どちらのメンブレンも、単一抗体による化学発光によって検出される豊富な中分子量タンパク質 (30 ～ 80 kDa) に対して同等の結果をもたらします。標的がβ-アクチン、GAPDH、または通常の負荷量で高度に発現される別のハウスキーピングタンパク質である場合、どちらの膜も機能します。ラボにすでにあるものはすべて使用します。
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